原文作者：Diana Kwon

通过结合单细胞测序与绘制基因表达空间位置图的方法，科学家们正在揭开大脑非同寻常的细胞多样性的面纱。

通过名为 MERFISH 的空间转录组学技术，获得的小鼠大脑切片细胞类群分布图。来源: Vizgen

十九世纪末，Santiago Ramón y Cajal凭借其精细的神经组织手绘图彻底改变了神经生物学。这位西班牙医生兼科学家通过多年细致的显微镜工作绘制了那些图画，揭示了大脑细胞的独特形态。

“通过Cajal的研究，我们发现大脑的细胞与身体其他部位的细胞并不一样——它们有着令人难以置信的形态，别处都看不到。”美国麻省理工学院与哈佛大学博德研究所的神经科学家Evan Macosko说。

Ramón y Cajal的图提供了早期线索，帮助理解大脑如何支配其众多功能的关键可能在细胞水平上——从调节血压和睡眠到控制认知和情绪等。

尽管如此，一谈起大脑时，事实上关键信息仍然缺失。哈佛大学的生物物理学家庄小威说：“为了从根本上了解大脑，我们确实需要知道有多少种不同类型的细胞，它们是如何组织的，以及它们之间是如何相互作用的。”

庄小威解释说，神经科学家需要的是一种系统识别和绘制多种类型脑细胞的方法。现在，研究人员已经快要能拥有这种资源了，至少在小鼠中是如此。通过将高通量单细胞RNA测序与空间转录组学（确定哪些基因在单个细胞中表达以及这些细胞位于何处的方法）相结合，他们正在绘制迄今为止最全面的小鼠大脑图谱。接下来的关键步骤是找出这些分子定义的细胞类型的作用，并将各种大脑图谱整合在一起，创建一个统一的资源，供更广泛的神经科学界使用。

绘制大脑图谱

小鼠是一个是非常强大的实验平台，允许神经科学家以人类中无法实现的方式探究大脑。光遗传学（一种对动物进行基因改造的技术，科学家可以用光来控制它们的细胞活动）等工具提供了测试特定神经元如何影响行为的方法，但在人类身上进行这种操作不实际也不道德。

瑞典卡罗林斯卡研究所（Karolinska Institute）的神经科学家Sten Linnarsson说，通过基因表达谱定义细胞的单细胞脑图谱可以在两个物种之间架起一座桥梁。例如，对人类某种细胞类型感兴趣的研究人员可以利用基因表达模式在小鼠体内找到相同的细胞类型，并对这些细胞进行操作。基因表达还为研究人员提供了一种更细致的脑细胞分类方法，这种方法通常依赖于更粗略的特征，如物理结构、位置、连接和动作电位发放模式。

Linnarsson等人利用单细胞RNA测序技术绘制了这种综合图谱。早期的研究侧重于特定的大脑区域，如大脑皮层——大脑的外层。后来在2018年，两个研究小组将这项技术扩展到整个大脑。Linnarsson团队的一项研究分析了小鼠大脑、脊髓和外周神经系统中的近50万个细胞。研究小组利用计算机算法，根据细胞的基因表达模式对细胞进行分类，确定了265个“细胞群”，每个细胞群代表一种独特的、分子定义的细胞类型[1]。另一项研究由哈佛大学医学院和博德研究所（Broad Institute）的研究小组共同开展，其中包括Macosko，他们在小鼠大脑的69万个细胞中发现了565个细胞群[2]。

这些细胞群包括以前从未报道过的细胞类型。例如，Linnarsson的研究发现了七种星形胶质细胞，它们是非神经元细胞，具有一系列功能，从为神经元提供能量到维持神经元连接。在此之前，科学家们只了解四个大类的星形胶质细胞[1]。

不过知道一种细胞类型的存在是一回事，要知道它在哪里又是另一回事。Macosko说：“这两篇论文缺少的都是空间分布信息。”

研究人员需要一种方法，不仅能确定每个细胞中表达的基因，还能精确确定这些细胞在大脑中的位置。这就是空间转录组学的用武之地。

绘制细胞多样性图谱

被称为多重容错性荧光原位杂交（MERFISH）[3]。它的工作原理是为每种RNA分配一个条形码——DNA探针的独特序列，然后通过几轮显微镜成像系统地解码这些条形码。这些条形码具有“容错性”，其序列能承受一定错误，误读达到一定数量才会被错认为其他条形码。

在证明 MERFISH 可以同时解析培养人体细胞中的 1000 多个基因后，研究人员转而研究小鼠大脑，建立了特定区域的图谱，并比较了小鼠和人类的细胞组织[4]。其中，他们发现人类大脑皮层部分区域的胶质细胞（一类非神经元细胞，包括星形胶质细胞和小胶质细胞，即大脑中的常驻免疫细胞）比例高于小鼠，而且人类大脑皮层中神经细胞和非神经元细胞之间的相互作用也多于小鼠。

现在，庄小威和同事们将MERFISH推广到了全脑水平。研究小组将该技术应用于来自成年小鼠大脑的约800万个细胞，并将这些数据与相同细胞的单细胞RNA测序数据整合在一起，录入了5000多个具有不同转录特征的细胞群。研究小组3月在bioRxiv预印本服务器上公布了这一研究成果[5]，这是该领域一周内发表的三项研究之一。

其中第二项研究由华盛顿州西雅图市艾伦脑科学研究所所长曾红葵领导，也是将单细胞RNA测序与MERFISH[6]结合在一起（曾红葵、庄小威及他们小组的成员都参与了上述两项研究）。尽管这两项研究使用了类似的方法，但它们解决的问题不尽相同。第一项研究强调的是空间梯度——细胞群之间基因表达谱的渐变，以及被称为空间模块的离散、分子定义的大脑区域；而第二项研究关注的是被称为转录因子的DNA结合蛋白在定义不同细胞类型时的作用。庄小威说：“我们才刚开始。这组数据提供了对大脑分子和细胞结构的丰富见解，为未来的研究提供了宝贵的资源。”

第三项研究由Macosko及其同事完成，他们采用了一种不同的空间方法[7]。与依赖显微镜的 MERFISH 相比，Macosko使用了一种名为Slide-seq的测序方法。该技术能有效地将组织样本中的细胞RNA转移到镶有条形码微珠的表面。由于每个微珠的位置都是已知的，研究人员可以利用条形码确定相关RNA在组织中的位置。通过将这种方法与单核RNA测序（报告来自细胞核而非整个细胞的基因转录本）相结合，Macosko和他的团队创建了自己的小鼠脑图谱。

小脑切片的荧光显微照片。来源：Thomas Deerinck, NCMIR/SPL

这三项研究都获得了美国国立卫生研究院BRAIN 细胞普查网络（BICCN）的至少部分资助，这一项目支持致力于绘制小鼠和灵长类动物（包括人类）大脑全面细胞图谱的实验室。这三个实验室汇聚了相似的结论：小鼠大脑具有非凡的细胞多样性，其中很大一部分在大脑皮层之外。研究小组发现，大脑皮层的细胞类型较少，转录特征较为明显，而下丘脑、中脑和后脑等靠近大脑底部的区域则有更多彼此相似的细胞类型。

曾红葵推测，这种差异可能反映了这些区域不同的进化历史。下丘脑、中脑和后脑等区域主要负责关键生理功能，如进食、新陈代谢和运动，这些功能在不同动物之间是一致的，可能因而容纳了硬连接、高度特异的细胞类型，随着时间的推移基本没有什么变化。而在控制高层次认知功能、能够适应不断变化环境的大脑皮层中，细胞分化可能快得多。

Macosko的数据可在brainincelldata.org网站上公开获取；另外两项研究的数据可在brainimagelibrary.org网站上获取；庄小威说，艾伦研究所计划在今年晚些时候推出一个互动网站。

“这些研究非常出色。”卡罗林斯卡大学的神经科学家Konstantinos Meletis说，“它们表明，现在有可能使用大规模、针对性的方法来同时了解数百个基因的空间组织。”Meletis和同事们三年前发表了他们自己的全小鼠脑图谱，使用了一种不同的空间转录组学方法[8]（此项研究没有在单细胞水平上绘制整个大脑的图谱，但研究小组在某些区域证明，他们的技术可以与单细胞RNA测序相结合，达到细胞分辨率）。

不止基因表达

曾红葵说，单细胞基因表达图谱是神经科学界的宝贵资源。从分子特征中精确定位特定细胞类型的能力，使神经科学家能够开发工具，研究这些细胞在健康大脑和疾病中的功能。

但研究人员正在制作的图谱不仅限于此。

加州大学圣迭戈分校的分子遗传学家任兵与索尔克研究所的分子生物学家Joe Ecker联手，绘制了小鼠大脑的表观遗传图谱。Ecker的实验室已经开发出一种方法，可以在单个细胞的整个基因组中检查DNA甲基化（可以改变基因表达的DNA化学修饰）。而任兵的团队设计出一种技术，分析染色体可触及区域外观，这些区域标志着基因表达和调控活跃的区域。“我们认为，通过定义不同细胞类型的表观基因组，可以用另一种方法定义细胞身份。”任兵说。他补充说，这种方法使研究小组既能识别不同的脑细胞，又能更全面地确定每种细胞类型的基因调控机制。

结合这些技术并将其应用于整个小鼠大脑，任兵、Ecker及同事发现了4000多个细胞类型。研究小组于4月在bioRxiv上发布了他们的研究报告（该研究也是BICCN的一部分），报告称他们发现的细胞类型与使用空间转录组学确定的细胞类型基本一致[9]。

与此同时，在中国上海，中国科学院神经科学研究所的神经科学家严军和同事们一直在绘制大脑中单个神经元之间的长距离连接图——“投射组”。他们开发了一种计算算法，可以通过追踪小鼠前额叶皮层中单个神经元的轴突（携带电信号离开神经细胞胞体的长纤维）来识别这些联系，在人类身上，前额叶皮层是参与决策、情感和感知等活动的大脑区域[10]。此后，研究小组又将研究范围扩大到树突[11]（接收信号的神经细胞分支），并将目光投向了整个大脑的投射组。

“神经系统是一个网络。”严军解释说，“而网络的功能来自于连接性。”

还有人正在绘制大脑随时间变化的图谱。美国宾夕法尼亚州立大学的神经科学家Yongsoo Kim正在利用高分辨率成像技术绘制小鼠大脑从胚胎阶段开始的整个发育过程的三维图谱。Kim说，目前有一个“很炫酷的”成年小鼠大脑参考资料——艾伦小鼠大脑通用坐标框架，它是根据1600多只小鼠大脑的高分辨率成像创建的[12]。但即使是这一资源也只代表了一个时间点；通过创建更多的“通用坐标框架”，Kim 和他的团队希望能为构建跨发育阶段的图谱提供一个模板。

从小鼠到人类

现在，研究人员正在将这些技术应用于包括人类在内的大型哺乳动物。去年，美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）宣布为 “BRAIN计划细胞图谱网络”（BICAN）提供5亿美元资金，用于绘制人类大脑的综合图谱。

但人脑面临的挑战要大得多：首先，人脑中的细胞数量估计是小鼠大脑的数千倍。科学家利用人脑组织进行的实验种类也很有限——研究必须使用死后材料，而且与实验室小鼠相比，人与人之间的差异更大，而小鼠通常具有相同的遗传背景，并在相同的环境中长大。

尽管如此，针对人类大脑的研究工作已经带来了新的启示。在一项分析[13] 中，Linnarsson和同事利用单核 RNA 测序技术研究了人脑中的 300 万个细胞。他们的研究于2022年10月发布在bioRxiv上，结果显示，与小鼠一样，位于中脑和后脑等区域的细胞类型要多于大脑皮层。Linnarsson说：“在人类中，我们往往以大脑皮层为中心来看待大脑。”但这些发现表明，研究人员可以更多地关注这些经常被忽视的其他脑区。

与此同时，研究人员正在深入研究空间细胞图谱，探索这些新发现的细胞类型的作用。例如，庄小威团队研究了不同细胞类型的空间接近性及其基因表达模式，从而推断出细胞与细胞之间的相互作用，这是揭示产生不同大脑功能的分子和细胞机制的重要线索。Macosko说，他的团队已经开发出一种算法，可以用来确定区分某种细胞类型所需的最少基因数量——这种资源就像给了神经科学家的实验一本“食谱书”。

研究人员甚至可以利用这些图谱来寻找疗法。现有的精神和神经疾病疗法往往利用笼统的细胞分类——例如针对多巴胺或血清素特异性神经元。但正如这些图谱所示，大脑中有成千上万种细胞类型，这种多样性蕴含着潜能，以研究人员以前想不到的方式调节细胞行为。“在治疗角度上，这蕴藏着巨大的机遇，来了解这些不同的细胞类型如何影响认知、情绪，还有生理。”Macosko说。

参考文献：

1.Zeisel, A. et al. Cell 174, 999–1014 (2018).

2.Saunders, A. et al. Cell 174, 1015–1030 (2018).

3.Chen, K. H., Boettiger, A. N., Moffitt, J. R., Wang, S. & Zhuang, X. Science 348, aaa6090(2015).

4.Fang, R. et al. Science 377, 56–62 (2022).

5.Zhang, M. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2023.03.06.531348 (2023).

6.Yao, Z. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2023.03.06.531121 (2023).

7.Langlieb, J. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2023.03.06.531307 (2023).

8.Ortiz, C. et al. Sci. Adv. 6, eabb3446 (2020).

9.Liu, H. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2023.04.16.536509 (2023).

10.Gao, L. et al. Nature Neurosci. 25, 515–529 (2022).

11.Gao, L. et al. Nature Neurosci. 26, 1111–1126 (2023).

12.Wang, Q. Cell 181, 936–953 (2020).

13.Siletti, K. et al. Preprint at bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.10.12.511898 (2022).

原文以The quest to map the mouse brain标题发表在2023年8月16日《自然》的技术特写版块上

nature

doi:10.1038/d41586-023-02559-9

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